А.В. Гудков, А.Л. Юдин, Ю.И. Подлипаева

Хорошо известна огромная, основополагающая роль коллекций тех или иных живых организмов в современных экспериментально-биологических исследованиях самого различного плана. Существуют большие коллекции национального масштаба, такие, например, как American Type Culture Collection (ATCC), а также разноообразные специализированные зоологические, ботанические, микробиологические и т.п. коллекции, поддерживаемые иногда в отдельных научных учреждениях и лабораториях, но имеющие тем не менее важнейшее значение для исследования биологии различных групп организмов (например, Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), Canadian Center for the Culture of Microorganisms (CCCM), All-Russian Collection of Microorganisms (VKM), и многие другие).

Классическим модельным объектом биологии уже более двух веков являются амебы типа Amoeba proteus (Ord, 1973; Юдин, 1982; Yudin, 1990; Jeon, 1995; Goodkov et al., 2010, и др.). Уже на ранних этапах использования этих одноклеточных эукариот в биологических исследованиях возникла необходимость создания коллекций разных видов амеб и разных штаммов того или иного вида, их паспортизации и сопоставимости. Такой коллекцией стала коллекция, собранная и поддерживаемая в Институте цитологии Российской академии наук.

Коллекция ведет свое начало с 1960 г., когда в Лаборатории цитологии одноклеточных организмов проф. Ю.И. Оленовым было решено развернуть и расширить исследования, незадолго до этого начатые группой английских цитологов под руководством Дж.Ф. Даниэлли (Danielli, 1952). Направленность этих исследований – изучение сравнительной роли ядра и цитоплазмы в клеточной наследственности – и основной метод, используемый в них [микрургическая трансплантация клеточных ядер и цитоплазмы, разработанная для амеб Коммандоном и Фонбрюном (Commandon, de Fonbrune, 1939)] предопределили круг амебоидных простейших, отбираемых в коллекцию ИНЦ. Это должны были быть достаточно крупные амебы, хорошо переносящие микрургические операции, хорошо культивирующиеся и клонирующиеся в лаборатории, причем в строго контролируемых стандартных условиях (для выявления наследственных различий между штаммами).

Среди многих описанных в то время методик культивирования амеб почти сразу же была выбрана методика, предложенная Д. Прескоттом (Prescott, James, 1955; Prescott, Carrier, 1964). Эта методика позволила размножать в одинаковых условиях большое число штаммов (= клонов) Amoeba proteus разного происхождения, достигая при этом, с одной стороны, 80-100%-ной эффективности субклонирования, а с другой – получая амеб, свободных от примеси каких-либо других простейших, в количествах, достаточных для применения различных биохимических методов.

Этот же способ культивирования оказался пригоден для ведения культур и других видов и родов как одноядерных, так и многоядерных амеб семейства Amoebidae – Polychaos dubium (Schaeffer, 1916), Chaos carolinense (Wilson, 1900), Ch. illinoisense (Kudo, 1950), Ch. nobile (Penard, 1902), Amoeba borokensis Kalinina, Afon'kin, Gromov, Khrebtukova et Page, 1987, Metamoeba leningradensis (Page et Kalinina, 1984) Friz, 1992, Amoeba indica (Rao, 1971), Amoeba amazonas (Flickinger, 1974) Friz, 1992, а также многих неидентифицированных клонов, полученных от изолированных из природы амеб подобного ("proteus-like") типа.

Наряду с культурами, поддерживаемыми по указанной выше методике, Лаборатория располагает их дублями, которые культивируются в чашках Петри 4мм в диаметре на среде Прескотта с рисовыми зернами и инокулированной в среду смесью инфузорий Colpidium sp. и жгутиконосцев Chilomonas sp. Такая микросистема существует без обновления и пересадки 1-2 месяца и представляет собой "аварийное хранилище" штаммов.

Все штаммы коллекции время от времени реклонируются, а принятая в Лаборатории техника кормления культур и смены среды исключает возможность их засорения амебами других штаммов.

Подробное описание используемых в работе с коллекцией методики и технических приемов культивирования, а также состава сред представлены в ряде специальных публикаций (Юдин, 1975; Yudin, 1990; Kalinina, Page, 1992).

При экспериментальной работе с амебами бывает необходимо максимально синхронизировать культуру, чтобы клетки находились на одной и той же стадии клеточного цикла. В определенной степени это может быть достигнуто специальным режимом кормления и смены среды (Махлин, 1993). Недавно разработан новый надежный способ синхронизации культуры амеб путем их пиноцитарного кормления (Podlipaeva et al., 2013), приводящий к 85-98% синхронизации клеток по ядерному циклу, в зависимости от штамма и условий проведения экспериментов.

Штаммы амеб поступали в Kоллекцию ИНЦ в разное время из различных отечественных и зарубежных лабораторий и банков клеточных культур. Мы глубоко благодарны, в частности, д-рам М.М. Исаковой-Кео (Кафедра зоологии беспозвоночных, Ленинградский государственный университет), Миклошу Мюллеру (M. M?ller, Medical University, Budapest, Hungary), сестре Монике Тэйлор (Sister M. Taylor, Notre Dame Training College, Glasgow, Scotland), Мюриэль Орд (M.J. Ord, Southampton University, UK), Дэйвиду Прескотту (D.M. Prescott, University of Colorado, Boulder, USA), Фредерику Пэйджу (F.C. Page, Institute of Terrestrial Ecology, Cambridge University, UK) и др., предоставившим в наше распоряжение многие известные штаммы.

Коллекция также включает штаммы амеб, непосредственно основанные от изолятов, выделенных из природы в разных регионах мира.

Первоначально собираемая с генетическими целями, коллекция послужила и служит богатейшим материалом для разнообразных исследований, среди которых можно выделить четыре основных направления, базирующиеся именно на биологическом разнообразии, представленном в коллекции; эти направления очень условно можно обозначить как "генетическое", "физиологическое", "биохимическое" и "морфологическое".

Работы генетической направленности посвящены, в первую очередь, оценке сравнительной роли ядра и цитоплазмы, а также роли ядерно-цитоплазматических взаимоотношений и эпигенетических механизмов в клеточной наследственности. В этих работах в качестве признаков – генетических маркеров – использовались почти исключительно так называемые природные (т.е. не индуцированные в эксперименте) наследственные различия между штаммами одного вида – A. proteus. Изредка в ходе культивирования того или иного штамма или экспериментов с ним выделяли "мутантные" формы, отличавшиеся теми или иными наследственными особенностями от исходного типа (Ord, 1970; Горюнова, Калинина, 1977; Николаева, Селиванова, 1979; Nikolaeva et al., 1979). Существенно, что наличие в коллекции многих штаммов этого вида, использовавшихся в аналогичных работах зарубежных исследователей, делало более сопоставимыми данные, получаемые в нашей и других лабораториях.

Основные результаты работ по изучению ядерно-цитоплазматических взаимоотношений, клеточной изменчивости и наследственности у этих облигатно агамных одноклеточных микроорганизмов представлены в монографии А.Л. Юдина (1982).

В рамках этого же направления проводили исследования по сравнительной оценке количества ДНК в ядрах амеб разных штаммов, спонтанной и индуцированной "полиплоидизации" ядер, изучали особенности синтеза ДНК в ходе клеточного цикла методом цитофлуориметрии (Афонькин, 1983; Afon'kin, 1989; Махлин, 1987, 1993, и др.). Была предпринята попытка применить конфокальную микроскопию для изучения структуры интерфазного хроматина в ядре A. proteus, а также для определения связи между гиперрепликацией ДНК и ее содержанием в ядрышках (Борисенко и др., 2010).

В результате поисков генетических маркеров для генетических исследований накапливались данные о природной, а также и индуцированной наследственной изменчивости в пределах вида A. proteus. По преимуществу это были данные о физиологических различиях между штаммами, относимыми к этому виду. Так, весьма значительный материал был собран по зависимости различных физиологических показателей клетки от температуры культивирования (Сопина, 1968, 1976, 1978, и др.). Позднее акцент был перенесен на исследование биохимических признаков – прежде всего белкового полиморфизма (изозимного спектра ряда ферментов), поверхностных антигенов и т.д. (Sikora, Kalinina, 1975; Kalinina et al., 1980; Сопина, 1986, 1991, 2000; Сопина, Юдин, 1994; Podlipaeva, Yudin, 2001, и др.). Аналогичные данные были получены и в отношении разных штаммов многоядерных видов амеб Chaos carolinense, Ch. illinoisense и др. (Сопина, 1993, 1999).

Коллекционный материал был использован для проведения сравнительно-морфологических (в т.ч. ультраструктурных) исследований амеб, тонкой организации интерфазных ядер и митотического аппарата клеток разных штаммов A. proteus, а также других видов и родов семейства Amoebidae (Gromov, 1985; Громов, 1986а, 1986б; Page, 1986). Полученные в этих исследованиях данные во многом были положены в основу современной классификации представителей семейства Amoebidae (Page, 1986, 1988). Работа с коллекцией позволяет дополнить морфологические данные физиологическими и биохимическими; при этом очень важно, что все эти данные получаются в стандартных, идентичных для сравниваемых форм, условиях, дающих возможность дифференцировать генетические и модификационные различия этих форм. На основании таких комплексных исследований два коллекционных штамма амеб – штаммы Bor и Sh – были выделены и описаны в качестве новых самостоятельных видов рода Amoeba – A. borokensis (Kalinina et al., 1986) и A. leningradensis (Page, Kalinina, 1984), соответственно.

Амебы разных штаммов из коллекции ИНЦ были использованы в качестве модельных объектов при исследовании механизмов клеточной адаптации к изменениям условий окружающей среды (а именно, температуры и солености). В клетках всех изученных штаммов методом иммуноблоттинга было выявлено присутствие белков теплового шока семейства 70кДа (т.н. БТШ70 - наиболее широко распространенных в живой природе белков стресса, характеризующихся высокой шаперонной активностью). Показано, что интактные (не подверженные стрессу) клетки всех видов и штаммов рода Amoeba характеризуются относительно высоким конститутивным уровнем содержания БТШ70, что было предложено рассматривать как преадаптацию этих одноклеточных микроорганизмов к воздействию неблагоприятных факторов (Podlipaeva, 2001; Плеханов и др., 2006; Подлипаева, Гудков, 2009; Goodkov et al., 2010).

Необходимо упомянуть еще об одном направлении исследований, которое оказалось возможным только благодаря наличию уникальной коллекции штаммов амеб. Как известно, в естественных условиях у амеб вида A. proteus и близких видов рода Amoeba симбиоз с фотосинтезирующими эукариотными организмами – такими, в частности, как Chlorella, – не встречается. Все попытки искусственным путем получить такую ассоциацию, предпринимавшиеся неоднократно чуть ли не с самых первых работ по экспериментальному изучению симбиотических ассоциаций у простейших, оканчивались неудачей (см.: Карпов, 1993). Тем не менее, в результате исследований коллекционного материала была показана возможность экспериментального заражения амеб некоторых штаммов хлореллами – симбионтами инфузории Paramecium bursaria (Афонькин, Гудков, 1989; Карпов и др., 1991). В цитоплазме одного из штаммов – штамм Amazonas - хлореллы устойчиво сохраняются при культивировании простейших на протяжении нескольких лет, причем такая искусственно полученная новообразованная симбиотическая ассоцияция обладает всеми основными признаками типичного внутриклеточного симбиоза (Карпов, 1993; Tchistyakova et al., 1997).

Сказанное можно дополнить следующим. Даже в те исследования, которые имеют по преимуществу цитологический характер и в которых "proteus-like" амебы "просто" используются как удобная модель крупной эукариотной клетки, – даже в такие исследования коллекция позволяет вносить сравнительный аспект, полнее характеризовать те или иные изучаемые процессы, структуры и их динамику. Это в полной мере относится к исследованиям механизмов клеточной подвижности (амебоидного движения), фагоцитоза, температурных или соленостных адаптаций, эндоцитобиоза и т.д., не говоря, опять-таки, о том, что благодаря коллекции эти исследования могут проводиться на стандартном и сопоставимом материале.

В настоящее время коллекция Лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН – это единственное в мире столь многочисленное собрание штаммов (клонов) свободноживущих пресноводных амеб семейства Amoebidae, многие из которых достаточно подробно и всесторонне охарактеризованы. К сожалению, часть старых штаммов была невозвратно утрачена, некоторые штаммы сознательно удаляли из коллекции в случае возникновения подозрения в их контаминации другими штаммами, однако коллекция постоянно продолжает пополняться новыми поступлениями. Далее мы приводим наиболее полный, содержательный и выверенный каталог коллекции среди списков, публиковавшихся ранее, в отдельных экспериментальных работах и обзорах.

БИБЛИОГРАФИЯ РАБОТ, В КОТОРЫХ БЫЛИ ИСПОЛЬЗОВАНЫ КОЛЛЕКЦИОННЫЕ ШТАММЫ

Афонькин С.Ю. 1983. Содержание ДНК в ядрах разных штаммов Amoeba proteus по данным цитофлуориметрии. Цитология. 25 (7), 771–776.

Афонькин С.Ю., Гудков А.В. 1989. Переживание хлореллоподобных эндосимбионтов Paramecium bursaria в цитоплазме свободноживущих амеб. Цитология. 31 (8), 976–980.

Борисенко И.Е., Подлипаева Ю.И., Гудков А.В. 2010. Нуклеиновые кислоты в интерфазном ядре Amoeba proteus: конфокально-микроскопическое исследование. Цитология. 52 (8), 647.

Горюнова Л.Б., Калинина Л.В. 1977. Наследуемые изменения, индуцируемые рибонуклеазой у Amoeba proteus. В кн.: Молекулярные основы структуры и функциональной активности клеток. Вып. 18. Ленинград, Наука. 51–53.

Громов Д.Б. 1986а.Ультраструктура ядер многоядерной амебы Chaos carolinense (Wilson). Цитология. 28 (4), 446–447.

Громов Д.Б. 1986б.Ультраструктура митоза многоядерной амебы Chaos nobile. Цитология. 28 (12), 1351–1355.

Демин С.Ю., Бердиева М.А., Подлипаева Ю.И., Юдин А.Л., Гудков А.В. 2015. Организация хроматина в клеточном цикле Amoeba proteus по данным о птической томографии. Цитология. 57, 813–822.

Демин С.Ю., Бердиева М.А., Подлипаева Ю.И. , Юдин А.Л., Гудков А.В. 2016. Кариотипирование Amoeba proteus. Цитология. 58, 971–976.

Демин С.Ю., Подлипаева Ю.И., Бердиева М.А., Гудков А.В. 2017. Кариотип Amoeba borokensis из группы близкородственных видов «proteus-подобных» амеб (Amoebozoa: Euamoebida). Цитология. 59, 718–723.

Демин С.Ю., Бердиева М.А., Гудков А.В. 2018. Циклическая полиплоидия у облигатно агамных амеб. Цитология. 60, 935–938.

Карпов А.С. 1993. Некоторые свойства искусственно полученных симбиотических ассоциаций амеб с хлорофитовыми водорослями Chlorella sp. Цитология. 35 (4), 115–126.

Карпов А.С., Гудков А.В., Афонькин С.Ю. 1991. Переживание зоохлорелл – симбионтов Paramecium bursaria – в цитоплазме крупных свободноживущих амеб различных видов и штаммов, различающихся по характеру протекания начальных этапов пищеварения. Цитология. 33 (4), 105–115.

Махлин Е.Е. 1987. Вариабельность количества ДНК, синтезируемой в ядрах амеб Amoeba proteus, в клеточном цикле. Цитология. 29 (12), 1379–1384.

Махлин Е.Е. 1993. Синтез избыточной ДНК в ядрах амеб Amoeba proteus в клеточном цикле. Цитология. 35 (3), 109–121.

Николаева Г.В., Селиванова Г.В. 1979. Микроспектрофотометрическое исследование кристаллических включений Amoeba proteus различных штаммов. Цитология. 21 (7), 867–871.

Плеханов А.Ю., Смуров А.О., Подлипаева Ю.И., Иванова Л.О., Гудков А.В. 2006. Белок теплового шока пресноводных простейших и его участие в адаптации к изменению солености среды обитания. Цитология. 48 (6), 530–534.

Подлипаева Ю.И., Гудков А.В. 2009. Белки теплового шока семейства 70 кДа в клетках свободноживущих и амфизойных амебоидных организмов. Цитология. 51 (12), 1019–1024.

Сопина В.А. 1968. Межклоновые различия по теплоустойчивости у амеб. Цитология. 10 (2), 207–217.

Сопина В.А. 1976. Зависимость теплоустойчивости амеб от температуры культивирования. Экология. 4, 74–78.

Сопина В.А. 1978. Температурные адаптации у свободноживущих амеб. В кн.: Вопросы экологии простейших. Ленинград, Наука. C. 36–57.

Сопина В.А. 1989. Внутривидовой полиморфизм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у амеб Amoeba proteus. Цитология. 31 (2), 237–244.

Сопина В.А. 1991. Спектр электрофоретических форм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфатдегидрогеназы и глюкозодегидрогеназы у амеб, культивируемых при различных температурах. Цитология. 33 (7), 104–109.

Сопина В.А. 1993. Электрофоретические спектры глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и кислой фосфатазы у двух штаммов Chaos carolinense при двух разных способах их культивирования. Цитология. 35 (9), 46–56.

Сопина В.А. 1999. Электрофоретические формы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, кислой фосфатазы и эстераз у амеб Chaos carolinenese и Ch. illinoisense. Цитология. 41 (2), 218–222.

Сопина В. А. 2000. Электрофоретические формы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, кислой фосфатазы и эстераз у амеб рода Amoeba. Цитология. 42 (12), 1134-1143.

Сопина В.А., Юдин А.Л. 1994. Наследуемая нестабильность фенотипа амеб по быстроподвижной электроморфе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, индуцированная действием актиномицина D. Цитология. 36 (4), 365–371.

Юдин А.Л. Амеба. 1975. В кн.: Объекты биологии развития. М., Наука. С. 5–12.

Юдин А.Л. 1982. Ядерно-цитоплазматические взаимодействия и клеточная наследственность у амеб. Ленинград, Наука. 200с.

Afon'kin S.Yu. 1989. Induced and spontaneous polyploidization in large amebae. Int. Rev. Cytol. 115, 231–266.

Berdieva M., Bogolyubov D., Podlipaeva Yu., Goodkov A. 2016. Nucleus-associated actin in Amoeba proteus. Europ. J. Protistol. 56,191–199.

Berdieva M., Demin S., Goodkov A. 2019. Amoeba proteus and ploidy cycles: from simple model to complex issues. Protistology. 13, 166–173.

Demin S.Yu., Berdieva M.A., Podlipaeva Yu.I., Goodkov A.V. 2020. Karyotypic instability of endoprophase and mitotic cells of Amoeba sp.strain Cont from the “proteus-type” group (Amoebozoa, Euamoebida, Amoebidae). Europ. J. Protistol. 74. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2020.125691.

Goodkov A.V., Smurov A.O., Podlipaeva Yu.I. 2010. Free-living protists as a model for studying heat shock proteins in the cell. In: Handbook of Molecular Chaperones: Roles, Structures and Mechanisms. N.Y., Nova Science Publishers, Inc. pp. 293–312.

Goodkov A.V., Yudin A.L., Podlipaeva Yu.I. 2014. Collection of the proteus-type amoebae at the Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences. I. History, goals and research field. Protistology. 8, 71–75.

Goodkov A.V., Yudin A.L., Podlipaeva Yu.I. 2015. Collection of the proteus-type amoebae at the Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences. II. Index of strains and list of publications. Protistology. 9, 99–111.

Goodkov A.V., Berdieva M.A., Podlipaeva Yu.I., Demin S.Yu. 2020. The chromatin extrusion phenomenon in Amoeba proteus cell cycle. J. Eukaryot. Microbiol. 67, 203–208 (doi:10.1111/jeu.12771).

Gromov D.B. 1985. Ultrastructure of mitosis in Amoeba proteus. Protoplasma. 126, 130–139.

Kalinina L.V., Page F.C. 1992. Culture and preservation of naked amoebae. Acta Protozool. 31, 115–126.

Kalinina L.V., Gorjunova L.B., Sikora J. 1980. Antigenic specificity of Amoeba proteus nuclear transplants. Acta Protozool. 19, 333–338.

Kalinina L.V., Afon'kin S.Yu., Gromov D.B., Khrebtukova I.A., Page F.C. 1986. Amoeba borokensis n. sp., a rapidly dividing organism especially suitable for experimental purposes. Arch. Protistenk. 132, 343–361.

Nikolaeva G.V., Kalinina L.V., Sikora J. 1979. Transparent Amoeba proteus originated from the strain C. Acta Protozool. 19, 327–332.

Ord M.J. 1970. Mutations induced in Amoeba proteus by the carcinogen N-meyhyl-N-nitrosourethane. J. Cell Sci. 7, 531–548.

Ord M.J. 1973. Changes in nuclear and cytoplasmic activity during the cell cycle woth special reference to RNA. In: The cell cycle in development and differentiation. Cambridge. pp. 31–49.

Page F.C. 1986. The genera and possible relationships of the family Amoebidae, with special attention to comparative ultrastructure. Protistologica. 22, 301–316.

Page F.C. 1988. A new key to Freshwater and Soil Gymnamoebae. Ambleside, Freshwater Biol. Ass. 122p.

Page F.C., Kalinina L.V. 1984. Amoeba leningradensis n. sp. (Amoebidae): a taxonomic study incorporating morphological and physiological aspects. Arch. Protistenk. 128, 37–53.

Podlipaeva Y.I. 2001. Heat shock protein of 70 kDa in Amoeba proteus. Protistology. 2 (2), 123–129.

Podlipaeva Yu.I., Yudin A.L. 2001. Activity and thermoresistance of some Amoeba proteus enzymes with special reference to thermal adaptation of amoebae. Protistology. 2 (1). 54–62.

Podlipaeva Yu., Demin S., Goodkov A. 2013. New method for cell cycle synchronization in Amoeba proteus culture. Pritistology. 8 (1), 3–7.

Pushkareva V.I., Podlipaeva J.I., Goodkov A.V., Ermolaeva S.A. 2019. Experimental Listeria–Tetrahymena–Amoeba food chain functioning depends on bacterial virulence traits. BMC Ecol. 19 (1):47.

Sikora J., Kalinina L.V. 1975. Substrate detachment as a test of antigenic diversity of Amoeba proteus strains. Cytobiologie. 11, 480–482.

Tchistyakova L.V., Karpov A.S., Goodkov A.V. 1997. Experimentally induced endocytobiosis of Amoeba amazonas with different Chlorella vulgaris strains: fine structural investigations. Endocytobiosis and Cell Res. 12, 57–63.

Yudin A.L. 1990. Amoeba and other protozoa. In: Animal species for developmental studies. Vol. 1. Invertebrates. New York, London, Consultants Bureau. pp. 1–11.

⇑ В начало